来自上海交通大学系统生物医学研究院的陶生策研究团队,证实第二信使环二核苷酸(c-di-GMP)可以通过调控ethr-etha途径加强耻垢分枝杆菌对ETH的耐药性,并从结构上解释了这一具体机制。这一研究成果发布在2017年7月19日的Scientific Reports上。
肺结核(tuberculosis)是一种由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病,一直危害人类生命健康。2016年WHO统计(图一),2015年有1040万人新发患有结核病,180万人因该病死亡。此外,全世界约有48万人是MDR/XDR-TB,在中国有7万人为MDR/XDR-TB。目前临床上应用的一线药物:利福平(RFA)、异烟肼(INH)、吡嗪酰胺和乙胺丁醇,主要针对活动性、对药物敏感性的肺结核病。二线抗结核药物包括乙硫异烟胺(ETH)、丙硫异烟胺、丁胺卡那等,也逐渐出现不同程度的耐药性问题。虽然新开发的抗结核药物有贝达喹啉、德拉马尼等,但仍不足以对付耐药结核病。
图一 2015年全球TB发病情况
c-di-GMP是在一种普遍存在于原核生物界的第二信使分子,在原核生物体内广泛存在,且参与重要的生物学功能,比如生物膜形成、细菌的运动性、毒性分子的产生、细胞周期和分化等(图二)。但是目前已知的靶点不足以解释其广泛调控作用,尤其在分枝杆菌中c-di-GMP更只有零星研究。
图二 c-di-GMP的合成、降解及信号调控
研究团队前期应用MtbProt?结核分枝杆菌全蛋白质组芯片(芯片包含了4262种结核分枝杆菌重组蛋白,覆盖~95%结核分枝杆菌编码基因),在结核分枝杆菌中发现了至少30个重要的c-di-GMP直接相互作用蛋白,其中包括EthR。EthR是一个转录抑制因子,抑制二线药物ETH的激活剂EthA的转录。ETH和INH的作用机制相同,在被激活后作用于分枝菌酸合成途径中的还原酶InhA,但由于其毒性,目前作为一个二线药物使用,再加上耐药性问题的出现,所以一直不能很好的应用于治疗结核病。基于此,文中针对EthR靶点,对c-di-GMP在分枝杆菌中的调控机制进行深入研究。
首先,采用紫外交联-电泳和生物膜干涉的方法,团队验证了c-di-GMP和EthR的体外结合,并获得了结合解离常数。采用EMSA和生物膜干涉的方法研究了c-di-GMP对EthR的体外活性的影响。结果表明c-di-GMP与EthR的结合,可明显加强EthR与下游基因etha启动子的结合,并影响EthR和etha启动子区域结合的动力学常数。体内活性实验同样验证了此结果。
其次,通过药敏实验和杀菌曲线的测定,表明体内c-di-GMP水平的升高增强了耻垢分枝杆菌对ETH的耐药性,但是不影响对RFA和INH的敏感性。进一步,对耻垢菌株在添加一定量ETH的培养条件下的生长曲线进行了测定,结果表明c-di-GMP水平的升高有利于耻垢菌株的生长,并且依赖于ethr进行调控(图三)。
图三 c-di-GMP加强耻垢分枝杆菌对ETH的耐药性
通过结构模拟,研究团队发现c-di-GMP结合在EthR的Q125、R181和E190这三个氨基酸上,而这三个氨基酸是位于EthR的同源二聚体的中心口袋中(图四)。进一步的c-di-GMP与位点突变的EthR的结合验证实验表明了上述位点的重要性。进一步的结构模拟发现,c-di-GMP与EthR的结合模式在TetR家族蛋白中具有普遍性。
图四 c-di-GMP和EthR结合的结构图
由此,科学家们得到了一种可定能ETH耐药机制:c-di-GMP结合在EthR的Q125、R181、E190上,有利于维持EthR的同源二聚体的构象,进而有利于EthR与etha启动子区域的结合来抑制etha的转录,最后由于体内较少的EthA激活ETH,从而导致了ETH的耐药性(图五)。
图五 c-di-GMP通过ethr-etha途径调控ETH的耐药性
该研究不仅发现了一种新型的耐药性产生的方式——由小分子调控引起的,不再是传统的位点突变或修饰改变引入的耐药问题,同时也发现了c-di-GMP的一种新的调控功能及作用机制——通过结合TetR家族蛋白调控耐药性,不再是调控生物膜形成等引起耐药性问题。该发现对于研究结核分枝杆菌及对肺结核用药均有指引作用。
研究团队使用的MtbProt?结核分枝杆菌全蛋白质组芯片由广州博翀生物科技有限公司提供,可用于全局性的发现目标蛋白、小分子药物、核酸的相互作用蛋白,以为解析其作用机制提供线索。
博翀生物是国家高新技术企业,中国科学院生物物理研究所成果转化的标杆企业,广州市企业研发机构,专注于蛋白质芯片,是中国蛋白质芯片领域的领导企业,相继构建了世界独一无二的基于高纯度蛋白质的MtbProt?结核分枝杆菌蛋白质组芯片、登革热蛋白质组芯片、凝集素蛋白质芯片、大肠杆菌蛋白质组芯片,酵母蛋白质组芯片等,代理美国CDI公司, 目前世界上最高通量的HuProtTM人蛋白质组芯片,同时销售一系列细胞因子科研试剂盒,可提供血清标志物筛选、药物作用靶标发现、抗体特异性筛选、蛋白-核酸互作、蛋白-蛋白互作,蛋白翻译后修饰研究等多项蛋白水平组学技术服务项目。
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